强强联合-多维组学揭示转录因子对生物钟的主导性调节作用

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景杰编者按

生物节律在哺乳动物的生长和代谢调节中一直发挥着不可忽视的作用。核心生物钟调节周围生物钟，使机体生命活动保持在井然有序的状态。生物钟系统中，肝脏又是不可或缺的一部分。肝脏转录组研究发现与氧化代谢、线粒体功能等相关的基因表现出规律性的变化，其中转录因子对生物节律的调节有着关键性作用，例如转录因子DNA结合活性（TF DBA）调节转录组表达水平，影响核蛋白组的表达，可能继而会影响整个蛋白组、翻译后修饰，甚至其他水平的变化。

    最近国家蛋白组研究中心贺福初院士，秦钧教授，复旦大学丁琛教授、联合美国休斯敦大学的研究人员，通过多维组学结合的方法，以TF DBA为中心，整体而全面地诠释了小鼠肝脏生物节律的调节。发现免疫应激、脂肪酸代谢、细胞循环和葡萄糖代谢四个生物学过程表现出昼夜节律变化，证明TF DBA为调节肝脏生物节律的主导性因素，为研究肝脏中生物钟的调节提供了新的视角和多个维度的信息。

关键词：磷酸化修饰、生物钟、泛素化修饰、核蛋白组、转录因子TF

研究思路和成果

    以研究转录因子为核心，为了在多维组学上探究和理解生物钟系统，在测定TF DBA的同时，研究人员还测定了每个时间点的转录组、核蛋白组、全蛋白组、磷酸化组和泛素化组。时间周期为48 h，隔3 h，取样三只小鼠的肝脏进行测定（图 1）。

图 1 以转录因子为中心，利用多维组学研究小鼠肝脏的生物节律

    首先，研究人员测定了TF 结合蛋白的活性（TF DBA），研究其昼夜规律。利用catTFRE方法，基于Ravasi 等人报道的TF 数据库，鉴定到了617个DNA结合蛋白（DBPs），其中包括279个转录因子（TFs）和247转录共调节因子（TCs）。结果显示，在连续的昼夜周期内，DBPs、TFs和TCs的个数呈现出规律性的变化（图2）。

 图 2  连续的昼夜周期内，DBPs、TFs和TCs的个数分布玫瑰图

每6 h为一个时期，将周期分为4个时期——TP1、TP2、TP3和TP4，为了研究这四个时期蛋白对应的特定的功能，将不同时期表达水平高于其它TF两倍的TF（TP-specific TFs）做GO/Pathway富集，发现四个时期的蛋白分别在免疫应答、脂肪酸代谢、细胞循环和葡萄糖代谢方面富集，同时分别将在四个时期发生规律性变化的TP-specific TFs做同样的富集，得出相同的结果，表明在节律周期内（图3），每个时期肝脏发挥不同的功能，并且生物节律在调节肝脏细胞转录和生理功能方面起主导作用。

图 3 四个时期，TP-specific TFs和规律性变化的

TP-specific TFs的GO/pathway富集

为了研究规律性变化的TF DBA是否来源于TFs的表达水平，测了肝脏的核蛋白组，鉴定到了4,038个蛋白，105个TFs，79个有TF DBA数据，发现TF DBA和TF的蛋白丰度之间，相关性很低，PRM和WB实验也证明TFs的表达水平在节律周期内没有周期性的变化，说明TF DBA的周期性变化并不是来源于TF丰度的变化。

        根据相关报道，TF DBA的变化和磷酸化密切相关，于是测了磷酸化组，鉴定到9465个磷酸化的肽段，1657个蛋白，89个蛋白的磷酸化水平出现周期性变化，72个TFs，55个有DBA数据，22（40%）个蛋白的DBA出现节律性的变化，特别是Bmal1, Dbp, and Clock等几个核心生物钟TFs的磷酸化和DBA出现高度一致性，说明TF DBA的周期性变化来源于TF磷酸化修饰丰度的变化（图 4）。

 图 4 a 磷酸化组学的节律蛋白 b 主生物钟TFs活性和TFs磷酸化水平的相关性

之后，测定了转录组，根据转录组数据发现了46个主导性的TFs（DR TFs），其变化规律与其调节的下游基因一致。为了比较转录组和蛋白组的一致性，测定了肝脏组织的全蛋白组，共鉴定到6780个蛋白，575个节律性蛋白（图 5 a），功能富集结果和转录组一致，同样主要富集在免疫应答、脂肪酸代谢、细胞循环和葡萄糖代谢四个途径（图 5 b）。转录组中，有2349个转录本出现节律性变化，1256个在蛋白组中被鉴定到，只有133个同时在转录和蛋白组水平出现规律性变化，蛋白组水平上，发现了41个DR TFs，令人惊讶的是有40个和转录组水平一致。结果证明并不是所有规律性变化的mRNA都会翻译成蛋白质，TF DBA可能是调节小鼠肝脏昼夜节律的主要驱动因素。最后测定了蛋白的泛素化组，证明泛素化调节也是昼夜节律的重要调节方式。

图 5 a 代谢途径相关的节律蛋白 b 蛋白质和转录组节律蛋白的功能富集

总结

    本文以研究转录因子DNA结合活性为基础，结合转录组、蛋白组、磷酸化组和泛素化组，研究了小鼠肝脏的生物钟系统的调节机制，证明在蛋白质水平，尤其是TF DBA对生物钟系统的主导性作用。为研究小鼠肝脏的昼夜节律提供了全面而且丰富的多维组学数据。

参考文献

Yunzhi Wang, et al. (2018), A proteomics landscape of circadian clock in mouse liver. Nature Communications .

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